Mayr-Stihl trat 1960 in die väterliche Firma ein und war für den Bereich Werbung und Marktforschung verantwortlich. 1961 wurde sie mit ihren drei Geschwistern Kommanditistin, zwei Jahre später erhielt sie Prokura. Das schwäbische Unternehmen ist einer der weltweit führenden Hersteller von motorgetriebenen Geräten für die Forst-, Land- und Bauwirtschaft sowie für Privatkunden im Gartenbereich.
Nach dem Tod ihres Vaters 1973 wurde sie 1975 stellvertretende Vorsitzende der Geschäftsführung mit dem Zuständigkeitsgebiet Finanzen und Controlling. Bei ihrem Unternehmenseintritt beschäftigte Stihl 740 Mitarbeitende und erzielte einen Jahresumsatz von 12,8 Millionen Euro. Unter ihrer Führung, gemeinsam mit ihrem Bruder Hans Peter Stihl, entwickelte sich das Familienunternehmen Stihl zu einer international aufgestellten Unternehmensgruppe mit Produktionsstätten in Deutschland, den USA, Brasilien, der Schweiz, Österreich, China und den Philippinen mit einer ständig wachsenden Produktpalette. 2002 zog sich Eva Mayr-Stihl mit den Familiengesellschaftern aus dem operativen Geschäft zurück. Eva Mayr-Stihl wechselte sodann in den Stihl-Beirat.
Den zweiten Ankerpunkt im Leben von Eva Mayr-Stihl bildete ihre Arbeit als Stifterin. 1986 rief sie zusammen mit ihrem Ehemann Robert Mayr die gemeinnützige Andreas-Stihl-Stiftung ins Leben, die 2004 in Eva Mayr-Stihl Stiftung umbenannt wurde. Förderprojekte in den Bereichen Tierschutz, Bildung, Wissenschaft und Forschung sowie Kunst und Kultur sollten über die Stiftung finanziert werden. Aktuell unterstützt die Stiftung beispielsweise die Albert-Ludwig-Universität Freiburg über die Stiftungsprofessur für Forstgenetik und eine Forschungsgruppe zu Werkstoffkreisläufen. Außerdem schreibt die Eva Mayr-Stihl Stiftung alle zwei Jahre gemeinsam mit den forstwirtschaftlichen Fakultäten in Deutschland den Deutschen Forstwissenschaftspreis aus.
Am 11. November 2009 erhielt Eva Mayr-Stihl in der Frankfurter Paulskirche gemeinsam mit ihrem Bruder Hans Peter Stihl den „Preis Soziale Marktwirtschaft" der Konrad-Adenauer-Stiftung. 2011 folgten das Verdienstkreuz 1. Klasse des Verdienstordens der Bundesrepublik Deutschland sowie die Ernennung zur ersten Ehrenbürgerin der Stadt Waiblingen. Seit 2019 hatte Eva Mayr-Stihl die Ehrensenatorinnen-Würde der Universität Freiburg inne.